Ein Roman, niedrig

Jun 07, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12084 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine schnelle und genaue Erkennung der Keimbelastung wird für Lebensmittel-, Gesundheits-, Pharma- und Umweltanwendungen immer wichtiger. Um die Keimbelastung genau und hochempfindlich zu erkennen, haben wir ein neuartiges Mikrofluidikgerät mit einem integrierten Filter zum Einfangen der Zellen hergestellt. Die Keimbelastung wird auf dem Filterpapier in situ mithilfe der Redoxreaktion des fluoreszierenden Markers Resorufin nachgewiesen und für die Fluoreszenzmessung wird ein tragbares Mehrkanal-Fluorometer verwendet. Das mikrofluidische Gerät wurde auf einfache, kostengünstige und schnelle Weise durch mikrowelleninduziertes, thermisch unterstütztes Bonden hergestellt. Um die Verbindungsqualität der Mikrofluidikkassetten zu charakterisieren, wurden verschiedene Tests durchgeführt und das Filterpapiermaterial und die Filterpapiergröße optimiert. Primäre Bakterienproben der Bacillus subtilis-Kultur wurden durch das Gerät gefiltert, um die Leistungsparameter zu validieren und zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mit diesem Mikrofluidikgerät eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,037 KBE/ml erreicht werden kann, während die LOD in einer normalen Mikrofluidikkassette im Fluorometer und im Goldstandard-Spektrophotometer 0,378 bzw. 0,128 KBE/ml beträgt. Die Ergebnisse zeigen, dass durch diese Mikrofluidikkassette eine drei- bis zehnfache LOD-Verbesserung möglich ist und je nach gefiltertem Volumen innerhalb von drei Minuten eine empfindlichere Detektion möglich ist. Dieses neuartige Mikrofluidikgerät kann zusammen mit dem Fluorometer als schnelles tragbares Werkzeug für den hochempfindlichen, genauen und Hochdurchsatz-Bakteriennachweis für verschiedene Anwendungen verwendet werden.

Jedes Jahr erkranken und sterben Millionen Menschen an den Folgen von Nahrungsmittel-, Wasser- oder Medikamentenverunreinigungen1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation2 wird eine globale Krankheitslast von 45 % auf die biologische Belastung zurückgeführt. Bei der Herstellung von Biopharmazeutika ist auch die mit der Keimbelastung verbundene Kontamination ein großes Problem3. Daher sind Diagnosegeräte für die Identifizierung von Bakterien und ihrer Antibiotikaempfindlichkeit immer wichtiger geworden4,5. Für den Nachweis von Keimbelastungen stehen viele analytische Methoden zur Verfügung – Adenosintriphosphat-Biolumineszenz6, Durchflusszytometrie7, Nukleinsäureamplifikation8, Atmung7, Impedanzmethoden8 und Antikörpernachweis7, um nur einige zu nennen. Die meisten Erkennungstechniken erfordern eine relativ lange Erkennungszeit (3 Stunden bis 7 Tage)9. Wenn die Erkennungsraten außerdem ausreichend schnell sind, werden Kosten und Empfindlichkeit zu Einschränkungen10,11,12. Derzeit werden Zelllebensfähigkeitstests häufig in der Arzneimittelentwicklung eingesetzt, um Wachstumsfaktoren, Zytokine und zytotoxische Wirkstoffe zu untersuchen, die in der Lage sind, lebensfähige Zellen und Bakterien schnell zu erkennen. In den letzten Jahren wurde Resazurin bei Messungen der Lebensfähigkeit von Zellen eingesetzt, um die Oxidations-Reduktions-Funktion einer bestimmten Probe zu messen. Um die Keimbelastung schnell und empfindlich zu erkennen, hat unsere vorherige Studie13 die Verwendung eines USB-betriebenen tragbaren Fluorometers zum Nachweis lebensfähiger Zellen in einer bestimmten Probe gezeigt, basierend auf dem Nachweis von Resorufin mit hoher Quantenausbeute aus Resazurin. In diesem kostengünstigen System diente die Steigung der Fluoreszenzintensität als Kriterium für die Erkennung der Keimbelastung. Lebensfähige Zellen wurden mit dem Redoxindikatorfarbstoff Resazurin überwacht. Die zu untersuchende Probe wurde mit Resazurin versetzt und in eine speziell entwickelte Mikrofluidikkassette geladen und die Änderungsrate von Resazurin zu Resorufin wurde über das Fluorometer beobachtet. Um die Keimbelastung mit höherer Empfindlichkeit zu erkennen, wird in dieser Studie ein neuartiges Mikrofluidikgerät mit integriertem Filter zur automatischen Filtration und Erkennung mit dem berichteten Fluorometer und Assay vorgestellt.

Mikrofluidik hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer leistungsstarken Technologie entwickelt und findet Anwendung in mehreren Grenzforschungsbereichen, darunter analytische Chemie14, Pharmazeutika15, Synthese von Chemikalien16 und klinische Anwendung17,18. Mikrofluidik-Technologien wurden in letzter Zeit auch bei der Untersuchung von Mikroorganismen eingesetzt. Mikrofluidische Geräte im Mikromaßstab und mit großer Integration bieten viele besondere Vorteile, darunter niedrige Kosten, höheren Durchsatz und höhere Effizienz bei der Analyse von Mikroorganismen19,20,21,22,23 und Antibiotika-Persistenz24. Jüngste Entwicklungen in der Mikrofluidik nutzen Filterpapier auch als Mittel zum Einfangen und Nachweisen von Bakterien und erfreuen sich aufgrund der geringen Kosten, der einfachen Zugänglichkeit, Verarbeitung, Modifikation und Entsorgung immer größerer Beliebtheit25,26. Allerdings haben die gemeldeten papierbasierten Mikrofluidikgeräte eine sehr hohe Nachweisgrenze (LOD) im Bereich von 57 bis 500 KBE/ml und eine geringe Genauigkeit27,28,29,30. Die Geräte erfordern häufig komplexe Modifikationen, z. B. Antikörperfunktionalisierung, Immobilisierung von Nanopartikeln und UV-Härtung für Muster auf dem Filterpapier zur Erkennung27,28,29,30. Darüber hinaus sind die Geräte aufgrund einer bestimmten Antikörperfunktionalisierung häufig spezifisch für einen bestimmten Bakterienstamm27,28,29,30. Diese Nachteile verhindern, dass die schnellen, einfachen und kostengünstigen mikrofluidischen Geräte auf Filterpapierbasis in großem Umfang zum Nachweis von Bakterien, insbesondere bei Feldanwendungen, eingesetzt werden können.

In dieser Studie haben wir ein mikrofluidisches Gerät mit integriertem Filterpapier entwickelt und validiert, um lebensfähige Bakterienzellen zunächst einzufangen und schließlich zu erkennen. Zur Verbindung des mikrofluidischen Geräts wurde eine einfache, kostengünstige, schnelle und umweltfreundliche mikrowelleninduzierte, thermisch unterstützte Lösungsmittelbindung eingesetzt31. Das Einfangen der Bakterien erfolgt auf dem Filterpapier und der Nachweis erfolgt in situ. Nach dem Einfangen der Zellen auf dem Filterpapier wird wie zuvor berichtet ein Assay auf Resazurin-Basis verwendet und die Fluoreszenzänderung aufgrund der eingefangenen Zellen (falls vorhanden) mit dem zuvor entwickelten Mehrkanal-Fluorometer13 überwacht. Nach unserem besten Wissen haben wir in dieser Studie gezeigt, dass durch mikrowelleninduziertes Bonden erstmals ein mikrofluidisches Gerät mit integrierten Filterpapieren zur Erkennung von Keimbelastungen entwickelt werden konnte.

Für die Unterbringung und Unterstützung des Filterpapiers im Inneren des Geräts wurden verschiedene mikrofluidische Schichten entworfen und hergestellt. Wir haben verschiedene Materialien und Größen von Filterpapieren untersucht und die Parameter für eine höhere Fluoreszenzsignalausbeute und einen empfindlicheren Nachweis der Keimbelastung optimiert. Zur Validierung des Geräts wurde der Stamm Bacillus subtilis getestet. Bacillus ist ein weit verbreitetes grampositives Bakterium, das für Menschen, Pflanzen oder andere Organismen schädlich ist und schwere Infektionskrankheiten verursacht32,33,34. Verschiedene konzentrierte Bakterienproben wurden vorbereitet und zusammen mit der Negativkontrolle in derselben Menge durch das Gerät geleitet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die integrierte filterbasierte Mikrofluidikkassette eine viel höhere Empfindlichkeit und einen niedrigeren LOD aufwies als das Goldstandard-Fluoreszenzmessgerät-Spektrophotometer und eine normale Mikrofluidikkassette im Mehrkanalfluorometer. Außerdem kann der LOD durch Filterung mit höherem Volumen verbessert werden. Die durch das Mikrofluidikgerät erhöhte Empfindlichkeit kann zu einer höheren Nachweisgenauigkeit führen und der Nachweis kann im Fluorometer innerhalb von 3 Minuten nach 6 Stunden Inkubation der Proben erfolgen. Jedes Mikrofluidikgerät kostet etwa 1,6 US-Dollar und das 8-Kanal-Fluorometer etwa 1300 US-Dollar. Diese Kosten können durch eine Ausweitung der Produktion weiter gesenkt werden und sind im Vergleich zu herkömmlichen Instrumenten kostengünstiger. Das einfache, leicht zu verbindende Mikrofluidikgerät kann in Kombination mit dem Fluorometer zur schnellen, hochempfindlichen und genauen Erfassung der Keimbelastung in Gesundheits-, Pharma- und Umweltanwendungen verwendet werden und überwindet dabei die Einschränkungen der zuvor beschriebenen Mikrofluidikgeräte.

Die in dieser Studie verwendeten Polymethylmethacrylat (PMMA)-Platten wurden wie in unserer vorherigen Veröffentlichung31 beschrieben lasergeschnitten und verklebt. Kurz gesagt, mikrofluidische Kanäle wurden entsprechend den Anforderungen in Substrate geschnitten. Ethanol wurde mit einer Spritze oder Mikropipette entnommen und auf die Oberfläche der Folie gesprüht, um die gesamte Oberfläche des zu verklebenden PMMA zu bedecken. Die zu verklebenden PMMA-Platten wurden dann von Hand gepresst und dann in einen Polyetheretherketon (PEEK)-Schraubstock eingelegt und der gesamte Aufbau für 1,5 Minuten in die Mikrowelle gestellt. Die zum Kleben des Geräts verwendete absolute Ethanol- und Mikrowellenerhitzung ist sowohl für die Sterilisation des Filters als auch des Geräts wirksam.

Das mikrofluidische Gerät bestand aus sechs verschiedenen PMMA-Schichten unterschiedlicher Dicke und den Abmessungen 50 mm × 22 mm. Abbildung 1a zeigt das schematische Diagramm verschiedener Schichten, die für die Herstellung mikrofluidischer Geräte verwendet werden, mit den Schichtnummern daneben. Die oberste 0,2-mm-Schicht hatte eine Öffnung für den Ein- und Auslass. Zur Injektion und Entnahme der Proben wurden Luer-Locks aus Polycarbonat verwendet. Die zweite Schicht bestand aus einem Kanal, um die Probe aus dem Gerät zu leiten. Die dritte und vierte Schicht dienten als Träger für das Filterpapier mit Öffnungen oder Durchgängen, durch die die Probe filtrieren und passieren konnte. Die dritte Schicht besteht ebenfalls aus mehreren diagonalen Strukturen, die das Filterpapier stützen und eine Verformung während der Filtration verhindern. Die fünfte Schicht hatte einen Kanal zum Leiten der Probe durch das Filterpapier und die untere Schicht bildete eine Abdichtung für das gesamte Gerät. Der Filterdurchmesser war 2 mm größer als der der kreisförmigen Öffnung, um den gesamten Filterbereich abzudecken. Darüber hinaus wurde der Filterpapierdurchmesser so gewählt, dass er den Einlass- und Auslasskanal überlappt, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe gefiltert wird. Da sich der Fotodetektor auf der Unterseite des Geräts befindet, wurden die Kassetten so hergestellt und verklebt, dass die Probe durch den Einlass und zuerst durch die Unterseite des Filters gelangt und dann aus dem Auslass austritt. Dadurch wird verhindert, dass das Filterpapier die Emission der Fluoreszenz abschattet. Für die Verklebung wurde jede der Schichten mit Ethanol benetzt und das Filterpapier wie in Abb. 1a gezeigt zwischen die Schichten gelegt. Abbildung 1b zeigt ein tatsächliches Foto der Mikrofluidikkassette mit verschiedenen beschrifteten Abschnitten der Kassette. Um die Keimbelastung im entwickelten Mikrofluidikgerät zu erkennen, sind keine Oberflächenmodifikationen des Filterpapiers erforderlich, was den Gesamtprozess erleichtert, und nach dem Verkleben wurde keine Verformung im Filterpapier beobachtet.

(a) Verschiedene Schichten des mikrofluidischen Geräts, integriert mit Filterpapier mit entsprechender Dicke. (b) (Links) Foto eines verbundenen Mikrofluidikgeräts mit verschiedenen Abschnitten, (rechts) ein Mikrofluidikgerät mit der Resazurinprobe.

In dieser Studie wurden zunächst fünf verschiedene Filterpapiere getestet. Dabei handelt es sich um Polyethersulfon (PES), Polyacrylnitril (PAN), graues Polycarbonat (PC), Nucleopore Track Etched (NTE) und Nylonfilter. Diese verschiedenen Filterpapiere wurden aufgrund ihrer umfassenden Verwendung zum Einfangen und Nachweisen von Bakterien ausgewählt35,36,37,38,39. Die verschiedenen Filterpapiere wurden im Fluorometer auf Autofluoreszenz getestet. Die Filterpapiere wurden mit einem Locher aus den Filtermembranblättern geschnitten. Mikrofluidische Geräte wurden unter Verwendung der mikrowelleninduzierten Technik für alle Filterpapiere verbunden und es wurden Verformungen und Verzerrungen, d. h. Biegung und Rissbildung, festgestellt. Bei der Keimbelastungserkennung ist Sterilität ein wichtiges Anliegen. Da die Filterpapiere nicht vorsterilisiert sind, können sie je nach Lagerbedingungen anfällig für Kontaminationen sein. Daher wurden die Filterpapiere auf Sterilität getestet und das beste Filterpapier hinsichtlich Sterilität und Autofluoreszenz für weitere Experimente ausgewählt.

Zur Sterilitätsprüfung wurden 10 ml der Lysogenie-Brühe (LB) als Negativkontrolle mit verschiedenen unsterilen Filtern in einem manuellen Filtergehäuse filtriert. Die Zellen wurden anschließend in 1 ml frischem LB gewonnen und 200 µL der Probe wurden 24 Stunden lang bei 37 °C auf der Agarplatte inkubiert und die Kolonien wurden gezählt. Um die Wirksamkeit der Alkoholsterilisation zu bestimmen, wurden zusätzlich 5 ml 70 %iges Ethanol in eine sterile Petrischale gegossen. Die Filter wurden eine Minute lang in 70 % Ethanol eingeweicht. Anschließend wurden die Filter in Filterhalter eingesetzt und zweimal mit 10 ml sterilem entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden 10 ml LB durch sterile Filter filtriert und die Zellen in 1 ml frischem LB-Medium gewonnen und das obige Verfahren wiederholt, um die koloniebildenden Einheiten zu zählen.

Die Einzelheiten des Mehrkanal-Fluorometers sind in den Begleitinformationen beschrieben.

Die mikrofluidischen Geräte wurden bei Auswahl des Filterpapiermaterials und -durchmessers auf Undichtigkeiten und Platzen getestet. Für die Bersttests wurde der Einlass des Geräts an einen Druckluftstrom angeschlossen, der bis zu 60 psi erreichen kann, und der Auslass wurde verschlossen. Das Gerät wurde unter Wasser gestellt und der Durchfluss wurde jeweils um 1 psi erhöht, bis Luftblasen im aus dem verbundenen Gerät austretenden Wasser sichtbar waren und das Filterpapier auf Brüche und Verformungen untersucht wurde. Die gleichen Konfigurationen wurden auch zur Auswertung des Lecktests angewendet, nur wurde der Druck von Null leicht erhöht und die Kassette auf Luftblasen untersucht, die von den verbundenen Mikrofluidikgeräten stammten. Durch jeweils zehnmalige Durchführung der Dichtheits- und Bersttests wurden statistisch signifikante Werte für den Berstdruck und den Prozentsatz defekter Geräte ermittelt.

Darüber hinaus wurde das Druckaufbauprofil des Mikrofluidikgeräts getestet, um sicherzustellen, dass die Baugruppe aus Filterpapier und Mikrofluidikgerät über die nötige Bindungsfestigkeit verfügt, um dem Druck standzuhalten, ohne dass es während der Probeninjektion und -filtration zu Verformungen kommt. Der Druckabfall im Gerät wurde mit einem negativen Kontroll-LB-Medium und einer hochkonzentrierten (100 KBE/ml) Bakterienlösung nach 10-stündiger Inkubation bewertet. Der Druck wurde mit einer Spritzenpumpe und einer Drucksensorbaugruppe gemessen. Der Drucksensor (PendoTECH PMAT) wurde zwischen dem Einlass des Mikrofluidikgeräts und einer Spritzenpumpe platziert. Der Durchfluss der Spritzenpumpe wurde auf eine Geschwindigkeit von 5 ml/min eingestellt und 20 ml jeder Probe wurden filtriert. Für beide Proben wurde der Druckabfall berechnet und mit dem Bersttest verglichen, um die ordnungsgemäße Funktion des Filterpapiers und des Geräts sicherzustellen.

Die Vorbereitung der primären und sekundären Kulturzellen erfolgt auf die gleiche Weise wie in unseren vorherigen Veröffentlichungen13. Kurz gesagt wurde eine 50-ml-Primärkultur unter Verwendung von 200 µL Bacillus-Zellen hergestellt, die über Nacht bei 37 °C in einem Schüttler bei 150 U/min (Lab-line Instruments, Melrose Park, IL) gezüchtet wurde. Die optische Dichte der Primärkultur wurde mit 2,5 bei 600 nm (SpectraMax M5) gemessen. Die primäre Saatkultur (1 %) wurde zur Beimpfung einer 200 ml Sekundärkultur verwendet und bei 37 °C in einem Schüttler bei 150 U/min gezüchtet, um eine optische Dichte von 0,4 bei 600 nm (~ 3 × 108 KBE/ml) zu erreichen. Dies wurde 10 Minuten lang bei 5000 U/min (Avanti J-25 I-Zentrifuge, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen und die gewaschenen Zellen wurden in PBS, pH 7,2, resuspendiert. Diese Probe wird zur Herstellung von Reihenverdünnungen (in 50-ml-Röhrchen) von 1:10 bis 1:105 verwendet. Die 1:105 verdünnte Probe wird für weitere Verdünnungen verwendet, um eine Endkonzentration lebensfähiger Zellen zu erreichen, die anhand einer Standardplattenzählung kalibriert wird. Hierzu wurden verdünnte Proben von 1000 KBE/ml bis 1 KBE/ml hergestellt. Nach der Vorbereitung verschiedener Proben wurden diese 6 Stunden lang in Schüttelkolben bei 37 °C inkubiert, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung13 optimiert. Parallel dazu wurden 200 µL jeder Probe auf einer LB-Agarplatte verteilt und die Platten über Nacht in einen Inkubator bei 37 °C gestellt. Nach etwa 24 Stunden wurde die Anzahl der auf den Platten erscheinenden Kolonien gezählt. 5 µM Resazurin werden in unserer Studie hauptsächlich für die Reduktionsstudie verwendet. Der Mechanismus der Verwendung von Resazurin für den Lebensfähigkeitstest ist in den Zusatzinformationen angegeben.

Nach der Inkubation wurden die Proben durch den Einlass des Mikrofluidikgeräts geleitet. Ein bestimmtes Volumen (anfangs 1 ml) der Probe wurde langsam durch das Mikrofluidikgerät geleitet. Zum Einspritzen und Rückspülen der Proben wurden zwei Spritzen verwendet. Da es strukturbedingt zu Hohlräumen unter und über dem Filterpapier kam, wurden eventuell verbleibende Proben aus diesen Bereichen mit den Spritzen herausgespült. Nach dem Filtern aller Proben wurden 5 µM Resazurin entnommen und mit einer Spritze genau in der Menge (~ 150 µL) in die Kassette gedrückt, die benötigt wurde, um die Unterseite des Filterpapiers zu füllen, wo die Zellen eingeschlossen sind. Nach der Injektion des Resazurins wurde die Kassette sofort in einen Kassettenhalter im Mehrkanal-Fluorometer gelegt und die Fluoreszenz gemessen. Parallel dazu wurden die Proben auch in der normalen Mikrofluidikkassette (Abb. S2) im Fluorometer6 und in 96-Well-Platten im Spektrophotometer getestet. Bacillus subtilis wurde getestet, um die LOD für das filterintegrierte Mikrofluidikgerät mit den normalen Mikrofluidikkassetten im Mehrkanal-Fluorometer und 96-Well-Platten im Spektrophotometer zu vergleichen. Bakterienproben wurden in zwei verschiedenen Arten von Mikrofluidikkassetten und dem Spektrophotometer in Duplikaten vorbereitet und getestet. Jeder Test wurde mit den negativen Kontroll-LB-Medien durchgeführt. Das gesamte Versuchsprotokoll ist in Abb. 2 dargestellt.

Flussdiagramm der durchgeführten Versuchsprotokolle.

LOD wurde als die Zellkonzentration berechnet, die ein Signal induzieren kann, das dem Dreifachen des Rauschens entspricht.

Die Empfindlichkeit ist die durchschnittliche Fluoreszenzsteigung, die aus den verschiedenen Bakterienproben mit negativer Kontroll-LB berechnet wird, unter der Annahme, dass LB-Medien 0 KBE/ml enthalten. Das Rauschen ist definiert als die Standardabweichung der Schnittpunkte für verschiedene Antwortdiagramme desselben Experiments, das durchgeführt wurde, da der Schnittpunkt die Steigung des Fluorometers bei der Negativkontrolle ist. Der statistische Unterschied zwischen zwei beliebigen Stichproben wurde mit einem zweiseitigen statistischen t-Test berechnet. Ein p-Wert von ≤ 0,05 bedeutet, dass zwischen den Proben im Test ein signifikanter Unterschied besteht. Die gesamte Analyse wurde anhand von 3-minütigen Daten sowohl für das Spektrophotometer als auch für das Mehrkanal-Fluorometer berechnet.

Da Autofluoreszenz die Fluoreszenzmessung erheblich beeinträchtigen kann, sollte für diese Anwendung das Filterpapier mit der geringsten Autofluoreszenz ausgewählt werden. Die Autofluoreszenz verschiedener Filterpapiere wurde im Mehrkanalfluorometer mit dem Mikrofluidikgerät ausgewertet. Tabelle 1 zeigt die Autofluoreszenz im Mehrkanalfluorometer für mikrofluidische Geräte mit unterschiedlichen Filtermaterialien. Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass der graue PC-Filter die geringste Autofluoreszenz aufweist und der Nylonfilter die höchste. Die anderen vier Materialien weisen eine recht ähnliche Autofluoreszenz auf.

Obwohl der graue PC-Filter die geringste Autofluoreszenz aufwies, war er anfällig für Verformungen während des mikrowelleninduzierten Bondens. Daher wurde dieses Filterpapier aus dem weiteren Sterilisationstest verworfen.

Die Ergebnisse zur Sterilität verschiedener Filterpapiere sind in den Zusatzinformationen dargestellt. Basierend auf den Ergebnissen und unter Berücksichtigung der Vorsterilität, der Autofluoreszenz und der umfangreichen Einsatzmöglichkeiten wurde der PES-Filter für das Mikrofluidikgerät ausgewählt.

Damit das Filterpapier die gesamte Filterzone abdeckt und an Ort und Stelle bleibt, war der Filterdurchmesser durchweg 2 mm größer als die bereits erwähnten kreisförmigen Öffnungen mit unterschiedlichem Durchmesser. Es wurden drei verschiedene Durchmesser der kreisförmigen Öffnung getestet, nämlich 8,2 mm, 10,2 mm und 11,2 mm. Der Durchmesser von 8,2 mm wurde getestet, da er zur Fotodiodenöffnung im Kassettenhalter passt. Der maximale Durchmesser wurde auf 11,2 mm festgelegt, da eine Überschreitung dazu führen würde, dass das Filterpapier die Kanten der Kassette berührt und es zu Undichtigkeiten kommt. Das gleiche Volumen einer 0,1 µM Resorufinlösung wurde durchgeleitet und die Fluorometerreaktion wurde aufgezeichnet. Abbildung 3 zeigt die Fluoreszenzintensität für unterschiedliche Durchmesser des Fluorometers. Aus der Abbildung geht hervor, dass die Öffnung mit größerem Durchmesser aufgrund der größeren Emissionsfläche eine höhere Fluoreszenzintensität aufweist. Daher wurde für weitere Experimente der Filterdurchmesser von 13,2 mm gewählt.

Fluoreszenzreaktion von PES-Filterpapieren mit unterschiedlichen Durchmessern der kreisförmigen Öffnung.

Die Leckage und der Berstdruck der gesamten Baugruppe wurden wie bereits erwähnt getestet. Von 10 getesteten Mikrofluidikgeräten wurde beobachtet, dass nur 1 von 10 Geräten ausfiel. Dies ist ein Beweis für die Zuverlässigkeit des Bindungsmechanismus und der verbundenen mikrofluidischen Geräte. Der Berstdruck wurde mit und ohne Filterbaugruppe berechnet. Tabelle S2 in den Zusatzinformationen zeigt den durchschnittlichen Berstdruck von insgesamt 10 Geräten.

Darüber hinaus ist das Druckaufbauprofil der gesamten Mikrofluidik-Anordnung mit LB-Medien und einer Bakterienprobe von 1000 KBE/ml in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Wie man sehen kann, beträgt der maximale Druckabfall während der Filtration der 20-ml-Probe ~ 6 psi, was viel weniger ist als der durchschnittliche Berstdruck (29,2 psi) der gesamten Baugruppe und des Filterpapiers. Darüber hinaus wurden bei allen durchgeführten Bersttests keine Verformungen am Filterpapier festgestellt. Daher ist das mit dieser Methode verbundene mikrofluidische Gerät zuverlässig und ermöglicht die Filtration großer Volumina ohne Undichtigkeiten und Verformung des Filterpapiers.

Die Proben wurden in zwei verschiedenen Mikrofluidikkassetten im Fluorometer und 96 Well im Spektrophotometer getestet, um den LOD wie zuvor erwähnt zu bestimmen. Abbildung 4a zeigt die Reaktion verschiedener Bakterienproben mit der Negativkontrolle im Mikrofluidikgerät mit integriertem Filter. Die Messungen wurden alle 1,5 s durchgeführt und der Einschub zeigt einen Teil der 5-KBE/ml-Probenreaktion. Obwohl alle Proben doppelt getestet wurden, werden nur die Daten einer Probe grafisch dargestellt. Abbildung 4b zeigt die Reaktion von 5 KBE/ml Bakterienproben in der normalen Mikrofluidikkassette (C), der Mikrofluidikkassette mit Filter (CF) im Fluorometer und den 24-Well-Platten im Spektrophotometer.

(a) Unterschiedliche Bakterienprobenreaktionen im Fluorometer mit der Mikrofluidikkassette mit Filter. (b) Reaktion von 5 KBE/ml Bakterienprobe in zwei verschiedenen Kassetten im Fluorometer und im Spektrophotometer.

Abbildung 4a zeigt, dass mit zunehmender Bakterienlast eine höhere Steigung beobachtet wird als im LB-Medium, das nur eine sehr geringe oder keine Steigung aufweist. Abbildung S4 zeigt den Nachweisbereich nach der Filtration der LB- und Bakterienprobe und der Injektion von Resazurin. Für die Bakterienprobe wird der blaue Farbstoff Resazurin in rosa Resorufin umgewandelt, wie aus der Abbildung hervorgeht. Bei 20 und 100 KBE/ml ist nach einiger Zeit ein abnehmender Anstieg zu beobachten, der auf die Reduktion von Resorufin zu farblosem Dihydroresorufin zurückzuführen ist40. Bei höheren Konzentrationen erfolgt der Zerfall schneller und zu einem kürzeren Zeitpunkt. Aus Abb. 4b geht hervor, dass die Fluoreszenzsteigung bei Proben in CF-Kassetten deutlich höher ist als bei den C-Kassetten und dem Spektrophotometer. Die Steigungswerte betragen 3,28, 0,57 bzw. 0,33 au/s in CF, C im Fluorometer und im Spektrophotometer, was eine deutliche Steigerung der Empfindlichkeit mit den in den Filter integrierten Kassetten zeigt. Die durchschnittlichen Steigungswerte wurden zur Berechnung des LOD in verschiedenen Kassetten im Fluorometer und Spektrophotometer verwendet.

Abbildung 5a zeigt den Vergleich der Fluoreszenzsteigung zweier verschiedener mikrofluidischer Kassetten im Fluorometer und im Spektrophotometer für verschiedene bakteriell konzentrierte Proben. Abbildung 5b zeigt den LOD- und Empfindlichkeitsvergleich dieser Proben. Die Datenanalyse sowie die Fluoreszenzsteigung zur Berechnung von Empfindlichkeit und LOD sind in Tabelle 2 dargestellt. Die ersten vier Zeilen stellen die Steigungswerte für verschiedene Bakterienkonzentrationen zusammen mit der Negativkontrolle dar.

(a) Verschiedene Fluoreszenzsteigungen von CF, C in Bakterienproben im Fluorometer und 96-Well-Platten im Spektrophotometer. (b) Berechneter LOD und Empfindlichkeit von CF, C im Fluorometer und 96-Well-Platten im Spektrophotometer.

Aus Abb. 5a geht hervor, dass die Steigungswerte der LB-Medien für alle Proben deutlich kleiner sind als die der anderen bakteriell konzentrierten Proben. Dies wird auch durch die p-Werte des statistischen t-Tests in Tabelle 2 gezeigt. Außerdem sind die Steigungswerte bei steigenden Bakterienkonzentrationen für alle Proben höher, mit Ausnahme der Probe mit 100 KBE/ml in CF, die auf die Dihydroresorufin-Umwandlung zurückzuführen ist . Dennoch sind die Steigungswerte für Proben in CF in allen Fällen deutlich höher als die der anderen beiden Proben. Daher sind die CF-Mikrofluidikkassetten deutlich empfindlicher als die normalen Mikrofluidikkassetten und das Spektrophotometer. Abbildung 5b zeigt die Ergebnisse der Empfindlichkeit und LOD für alle für den linearen Bereich berechneten Proben. Den Ergebnissen zufolge sind die Kassetten mit integriertem Filter (CF) im Fluorometer viel empfindlicher als die beiden anderen Probentypen, was zu einem viel niedrigeren LOD führt. Der LOD ist um das 3,5-fache höher als beim Spektrophotometer und 10-mal höher als der C-Wert im Fluorometer. Der p-Wert des t-Tests zwischen den Empfindlichkeitswerten von CF und C beträgt 0,0097 und CF und Spektrophotometer 0,000079, was zeigt, dass die Empfindlichkeit für CF statistisch signifikant höher ist. Folglich sind die Proben in CF im Fluorometer bzw. Spektrophotometer etwa 14- bzw. 19-mal empfindlicher als C. Die genauen Werte sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Empfindlichkeit wurde anhand des linearen Bereichs (erste 3 Minuten) der Reaktionen unter Verwendung von Daten von 0 bis 20 KBE/ml berechnet, da die 100 KBE/ml eine nichtlineare Reaktion zeigten.

Unterschiedliche Volumina derselben konzentrierten Bakterienprobe (5 KBE/ml) wurden durch die Kassette geleitet, um die LOD mit unterschiedlichen Volumina von 1, 3 und 5 ml zu vergleichen. Die Beispielantwort für verschiedene gefilterte Volumina ist in Abb. 6a dargestellt. Der Empfindlichkeitsvergleich für unterschiedliche Volumina ist in Abb. 6b dargestellt.

(a) Fluorometerreaktion mit den Mikrofluidikkassetten mit Filter für variierendes gefiltertes Volumen von 5 KBE/ml Bacillus (b) Empfindlichkeit des Mikrofluidikgeräts mit zunehmendem Filtratvolumen zusammen mit der Negativkontrolle LB.

Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass mit zunehmendem Volumen, das durch das Mikrofluidikgerät gefiltert wird, die Intensität und Steigung der Fluoreszenz deutlich zunimmt. Die Erhöhung wiederum erhöht die Empfindlichkeit des mikrofluidischen Geräts mit dem Fluorometer, wie in Abb. 6b dargestellt. Je mehr Volumen gefiltert wurde, desto mehr Zellen wurden auf dem Filterpapier zurückgehalten. Dadurch wurde Resazurin schneller zu Resorufin reduziert. Bei höheren gefilterten Volumina, in diesem Fall bei 5 ml, verringert sich die Empfindlichkeit oder die durchschnittliche Fluoreszenzsteigung. Dies ist auf die nach einiger Zeit abnehmende Steigung zurückzuführen, die auf die aus Abb. 6a ersichtliche Reduktion von Resorufin zu farblosem Dihydroresorufin zurückzuführen ist. Eine ähnliche Änderung der Reaktion und Empfindlichkeitssteigerung mit steigendem Volumen für 20 KBE/ml ist in Abbildung S5 dargestellt. Dennoch sind die Fluoreszenzintensität und -empfindlichkeit deutlich höher als bei Negativkontroll-LB-Medien, was das Vorhandensein einer Keimbelastung bestätigt. Es ist möglich, mit diesem Mikrofluidikgerät mehr Volumina zu filtern, um gegebenenfalls sehr niedrige Keimbelastungskonzentrationen zu erkennen.

Unser Gerät und unsere Methode können Bakterien innerhalb von 6 Stunden nach der Inkubation mit im Labor kultivierten Proben nachweisen, wodurch die Nachweiszeit um mindestens das Vierfache gegenüber der Golden-Standard-Kulturmethode verkürzt wird. Die vergleichsweise schnellen Methoden wie PCR, ELISA und andere Biosensormethoden haben den Nachteil einer geringen Empfindlichkeit, eines falsch positiven Nachweises, eines technisch komplizierten Verfahrens und hoher Kosten. Nach der Inkubation dauert die Probeninjektion je nach Volumen nur eine Minute und ist einfach durchzuführen. Während andere bakterielle Nachweisverfahren, z. B. PCR, ELISA und Bakterienkulturmethoden, bestimmte Verfahren, technische Vorbereitungen und äußerst saubere Betriebsbereiche erfordern, sind diese komplizierter und erfordern geschultes Personal. Hier übertrifft unser mikrofluidisches Gerät mit dem Fluorometer andere herkömmliche Methoden zur Erkennung extrem geringer Keimbelastungen. Der optimierte Assay kann mit diesem Gerät auch zum Nachweis anderer Stämme mit höherer Empfindlichkeit verwendet werden.

In einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der öffentlichen Gesundheit, besteht ein inhärenter Bedarf an einer schnellen und empfindlichen Erkennung der Keimbelastung. Um die Keimbelastung mit höherer Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erkennen, wurde in dieser Studie ein neuartiges mikrofluidisches Gerät hergestellt und auf einfache und umweltfreundliche Weise befestigt. Die Parameter der mikrofluidischen Kassette wurden in Verbindung mit dem Mehrkanal-Fluorometer für eine hochempfindliche Detektion optimiert. Das mikrofluidische Gerät hat sich bei der Erkennung von Keimbelastungen als wirksam erwiesen, und zwar mit einer viel höheren Empfindlichkeit als ein zuvor beschriebenes normales mikrofluidisches Gerät und das Spektrophotometer. Unsere zukünftigen Studien umfassen das Testen des Mikrofluidikgeräts mit anderen Bakterienstämmen, reale Tests, die Filtrationseffizienz von Filterpapier und die Implementierung verschiedener biologisch abbaubarer Materialien für die Herstellung und Bindung. Das mikrofluidische Gerät kann einen weitreichenden Einfluss auf die Erkennung von Keimbelastungen haben, insbesondere in einer Point-of-Care-Umgebung.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Diese Arbeit wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration im Rahmen des Vertrags Nr. unterstützt. BAA 75F40119C10132.

Zentrum für fortgeschrittene Sensortechnologie, University of Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 21227, USA

Md. Sadique Hasan, Chad Sundberg, Michael Tolosa, Xudong Ge, Yordan Kostov und Govind Rao

Fakultät für Informatik und Elektrotechnik, University of Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 2127, USA

Md. Sadique Hasan

Abteilung für Chemie-, Biochemie- und Umwelttechnik, University of Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 2127, USA

Chad Sundberg, Xudong Ge und Govind Rao

Champions Oncology Inc, 855 N Wolfe St, Baltimore, MD, 21205, USA

Abhay Andara

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MSH, CS und MT führten die Experimente durch. YK und GR haben das Projekt konzipiert. XG plante die Experimente und analysierte die Daten. MSH hat das Manuskript geschrieben. XG, AA, YK und GR überwachten die Forschung. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Govind Rao.

GR und YK sind als Erfinder im US-Patent 10.948.414 B2 „Methods and Apparatus for Rapid Detection of Bacterial Contamination“ aufgeführt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hasan, M., Sundberg, C., Tolosa, M. et al. Ein neuartiges, kostengünstiges Mikrofluidikgerät mit integriertem Filter für die schnelle, hochempfindliche Bioburden-Erkennung mit hohem Durchsatz. Sci Rep 13, 12084 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38770-x

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Eingegangen: 02. Mai 2023

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 26. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38770-x

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